В Результате Люблинской унии 1569 г., которая объединила Литву с Польшей, Киев вошел в состав Речи Посполитой. В настоящее время киевский воевода Константин Острожский, выдающийся меценат культуры и защитник православия, сплотил в Киеве, как и в своем родном Остроге, патриотически настроенное украинство. Брестская церковная уния 1596 г. официально узаконили греко-католическую церковь, которую большинство православного населения считала для себя неприемлемым. Киевляне ответили на унию духовной консолидацией. Твердыня веры оставалась Киево-Печерская лавра, где в 1615 г. архимандрит Єлисей Плетенецкий основал типографию. Того же года Галшка Гулевичивна, жена мозырского маршалка, подарила большой участок с домом на Подоле новом Киевском православному братству для размещения монастыря и школы.

В братство вступило много зажиточных мещан, часть шляхты и духовенства, а также гетман Петр Конашевич-Сагайдачный вместе с Войском Запорожским. Под защитой казачества иерусалимский патриарх Феофан, находясь в Киеве в 1620 г.восстановил здесь постоянную православную митрополию. Св. Петр Могила, митрополит киевский в 1633-47 г., приложил немало усилий для восстановления православных святынь. Он превратил школу Киевского братства на коллегию с блестящим преподавательским составом (позже заведение стал именоваться Киево-Могилянской академией, воспитанники которой прославились далеко за пределами Украины). Все это имело большое значение для подъема национального сознания населения и в конечном итоге способствовало освободительной борьбе украинского народа.